Una de sus primeras actuaciones ocurrió cuando los mártires Marcos y Marcelino estuvieron cerca de flaquear en su fe bajo la amenaza de la tortura y la muerte: Sebastián con sus palabras logró animarles a que confiaran en Dios.
También el prefecto de Roma abrazó el cristianismo tras oír hablar a Sebastián. El emperador Dioclesiano le nombró capitán general de la guardia pretoriana, ya que admiraba sus cualidades e ignoraba su religión. El palacio imperial se convirtió en el mejor refugio para los cristianos. Sin embargo, la persecución pronto dio con ellos. Sebastián fue descubierto, y el Emperador que había confiado en él, lo acusó de ingratitud y lo condenó a morir a manos de los arqueros que le dispararon hasta darlo por muerto. Por suerte fue encontrado aún vivo por Santa Irene, quien cuidó de él hasta su recuperación.
Sebastián, ya restablecido, se presentó ante el Emperador para reprocharle sus crueldades para con los cristianos. Dioclesiano, sorprendido de verlo aún con vida, ordenó que fuera golpeado con garrotes hasta la muerte y arrojado a la Cloaca Máxima, el lugar más inmundo de Roma. Los cristianos recuperaron su cuerpo y le dieron sepultura en las catacumbas de la Vía Apia.