Cinco años después fue nombrado maestro de los novicios. Como profesor San Luis era muy estricto y severo, y se preocupaba porque sus alumnos renunciaran sinceramente al mundo y se unieran perfectamente a Dios.
En 1562, San Luis Beltrán fue enviado a predicar el Evangelio a los indígenas de América y llegó al puerto de Cartagena, Colombia. Sólo hablaba español pero Dios le concedió el don de lenguas, profecía y milagros.
También trabajó en Tubera, Paluato, Cipacoa y Portavento. Durante su trabajo en América convirtió a miles de indígenas, desde el istmo de Panamá hasta en las islas del Caribe. Varios años después, en 1569, regresó a España donde se dedicó a la formación de los nuevos misioneros encargados de continuar su tarea evangelizadora en América.
Tras una dolorosa enfermedad San Luis Beltrán, patrono de Colombia, murió el 9 de octubre de 1581 y fue canonizado en 1671.