Nació en las cercanías de Florencia, en la Toscana, Italia, en el seno de una familia de la nobleza local,en el año 995.
La juventud de San Juan Gualberto estuvo marcada por un evento trágico: su hermano fue asesinado. Durante mucho tiempo buscó al culpable, hasta que finalmente lo encontró y lo tuvo postrado a sus pies.
En vez de vengarse del asesino arrebatándole también la vida, como había sido su propósito en un principio, San Juan Gualberto lo perdonó. La experiencia le hizo acudir a la iglesia, y ahí se decidió a dedicar su vida al servicio de Jesús crucificado. Tenía 18 años de edad.
Así ingresó en 1013 al monasterio benedictino de San Miniato, en los alrededores de Florencia. Sin embargo, pronto tuvo conocimiento de que el nuevo abad había obtenido el cargo por habérselo comprado al obispo. A este delito se le llama simonía.
Indignado, San Juan Gualberto abandona San Miniato, y por un tiempo se la pasa en busca de un nuevo monasterio, seguido por otros monjes que habían abandonado junto con él aquel corrupto sitio.En un lugar al pie de los Apeninos llamado Vallombrosa, crean hacia 1038 la Congregación Benedictina Vallombrosina, aprobada por el papa Víctor II en 1055, basada en la pobreza y en una austera vida comunitaria; la intención de la congregación era regresar a las enseñanzas de los Apóstoles, de los Padres de la Iglesia, de San Basilio y de San Benito.
Predicando siempre con el ejemplo, San Juan Gualberto se dedicó a su manera a combatir la corrupción que en esa época infestaba a la Iglesia, preocupándose especialmente por acabar con la simonía.Siempre dispuesto a apoyar la formación positiva del clero y a denunciar la corrupción interna, San Juan Gualberto fue extendiendo poco a poco los alcances de su misión.
En uno de sus viajes para promover el rigor de su regla en distintos monasterios, San Juan Gualberto falleció en el monasterio de Passignano, donde fue enterrado,en el año 1073. Al poco tiempo su tumba se convirtió en sitio de peregrinación, y se dice que ahí se obraron varios milagros.